АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Идентификация и очистка аллергенов

Лечебные и диагностические аллергены, наиболее часто используемые в клинической практике, — водно-солевые экстракты исходного аллергенного сырья. Таковы водно-солевые экстракты пыльцы растений, домашней пыли, шерсти животных, экстракты насекомых и пр. Такие экстракты содержат не один, а несколько аллергенов, т.е. тех действующих начал, которые способны вызывать сенсибилизацию, переключение синтеза иммуноглобулинов на синтез IgE и взаимодействовать с аллергенспецифическим IgE, вызывая аллергическую реакцию. Между разными аллергенами может существовать в той или иной степени структурная гомология, что объясняет столь распространённые перекрёстные аллергенные свойства. Так, например, лица, имеющие повышенную чувствительность к аллергенам берёзы, одновременно реагируют на пыльцу орешника, ольхи и некоторые фрукты и овощи (в частности, на яблоки). Индивидуальные аллергены, содержащиеся в данном экстракте, классифицируют на главные (основные), промежуточные и второстепенные. Такое подразделение основано на частоте реагирования на эти компоненты лиц, имеющих повышенную чувствительность к цельному экстракту. За главные компоненты принимают те, на которые реагируют не менее 50% лиц, имеющих повышенную чувствительность к цельному экстракту Для идентификации аллергенов и определения их состава используют методы химического, иммунохимического и биохимического анализа. Среди них наиболее часто применяют методы иммуноэлектрофореза, электрофореза в додецилсульфате натрия полиакриламидном геле (Sodium Dodecyl Sulphate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis — SDS–PAGE) и изоэлектрофокусирование в комплексе с иммуноблоттингом. Поскольку каждый из этих методов имеет серьёзные ограничения, окончательное заключение можно сделать только на основании сопоставления результатов, полученных разными способами оценки.

SDS–PAGE позволяет разделять белки по размеру их молекулы. Додецилсульфат натрия — сильный анионный детергент, который связывается с белками и маскирует собственный заряд белковых молекул. В таких условиях полиакриламидный гель выполняет роль простого молекулярного сита. Параллельное использование одновременно с образцами аллергена белковых маркёров с известной величиной молекулярной массы позволяет достаточно точно определить величину молекулярной массы компонентов, входящих в состав аллергенов. Следует иметь в виду, что на результаты разделения может оказывать влияние гликолизирование белков, приводящее к значительному увеличению молекулярной массы белковых молекул. Использование восстанавливающих агентов (меркаптоэтанола или динитрофенола), разрушающих дисульфидные связи, позволяет достичь диссоциации димерных и полимерных белков и повысить их растворимость. Затем разделённые белки наносят на нитроцеллюлозные или фторполивиниловые мембраны. Нанесённые на мембраны белковые пятна («блоты») инкубируют в присутствии сывороток крови больных, имеющих повышенную чувствительность к данному аллергену и соответственно содержащих IgE–АТ. Связывание IgE–АТ с аллергенными белками идентифицируют при помощи анти–IgE–АТ, меченных либо ¹²⁵I, либо ферментом, соответственно ауторадиографически или по образованию хемилюминесцентного продукта. Результаты метода, иначе называемого вестерн–блоттингом (Western blot), зависят от полноты ренатурации аллергенов.

Изоэлектрофокусирование позволяет разделять белки в соответствии с их изоэлектрической точкой в градиенте pH, создаваемом смесью соответствующих амфотерных молекул. Иммунохимическую идентификацию аллергенов проводят, используя тот же приём, что и при выполнении SDS–PAGE. Толкование результатов нередко затрудняется тем, что изоформы аллергенов обладают гетерогенным зарядом, разной степенью гликозилирования и другими вариабельными характеристиками.

Перекрёстный иммуноэлектрофорез — комбинация первичного электрофоретического разделения в геле агарозы и последующего электрофореза под прямым углом в геле агарозы, содержащем специфическую антисыворотку. В зоне эквивалентных соотношений концентрация Аг и АТ возникают преципитаты в виде «ракетных следов». Проявление присутствия в них аллергенов достигается при помощи использования сыворотки крови больных, которые чувствительны к данному аллергену, с последующим добавлением aнти–IgE–АТ, меченных ¹²⁵I и ауторадиографией. Понятно, что в этом случае результаты будут зависеть от качества антисыворотки, которая должна распознавать все антигенные компоненты аллергена, а также от достижения оптимальной концентрации АТ для возникновения иммунопреципитации.

Данные, характеризующие молекулярный размер и точку изоэлектрофокусирования, являются обоснованием выбора методов очистки конкретного аллергена. Многие аллергены (ингаляционные и пищевые) — гликопротеины с молекулярной массой от 5 до 70 кД и точкой изоэлектрофокусирования от 4 до 7. Однако встречаются и белки со свойствами основания (катионные белки). У разных изоформ аллергенов могут быть разные величины молекулярной массы и суммарного заряда, что зависит от соответствующих АК–замещений и различий углеводных компонентов.

Поскольку аллергены являются растворимыми белками и гликопротеинами, для их очистки применяют принципиально те же методы, что и для очистки белков. Первый этап очистки состоит в экстракции исходного сырья. При этом должны быть созданы условия максимального извлечения аллергенов при минимальной степени их разрушения и денатурации. Этого достигают прежде всего подбором величины pH, ионной силы раствора, буферного состава, продолжительности экстракции в зависимости от особенных свойств данного аллергена. Использование низкой температуры в период экстракции снижает степень разрушения экстрагируемых молекул.

В тех случаях, когда в экстрагируемом материале могут присутствовать протеолитические ферменты, необходимо использовать ингибиторы протеаз, как, например, при приготовлении аллергенов грибов и постельного клеща. При довольно длительных процедурах выделения аллергенов необходимо применять бактериостатические агенты — консерванты (мертиолат). Однако их допустимо использовать в очень низкой концентрации (0,005%).

Различные физико-химические методы очистки базируются на электрофоретическом и хроматографическом разделении материала, различающегося величиной молекулярной массы заряда и гидрофобными свойствами. Для хроматографического разделения в настоящее время применяют варианты высокоразрешающей жидкостной хроматографии (HPLC), преимущества которой состоят в большой емкости колонок, высокоразрешающих свойствах используемых смол, большой скорости разделения и высокой воспроизводимости.

Высокая степень очистки достигается использованием методов аффинной хроматографии. При этом в качестве аффинного материала используют либо соответствующие моноклональные АТ, либо лектин. Последний, разумеется, может быть использован в случае аллергенов гликопротеиновой природы. Лектин–аффинная хроматография имеет преимущества при выделении гликопротеинов из большого объёма и как этап последующего выделения из материала, полученного ионообменной хроматографией, так как связывание с лектином не зависит от концентрации солей. Избирательность выделения аллергенов лектиновой хроматографией определяется характером углеводных компонентов гликопротеинов. Конканавалин А распознаёт структуры, содержащие связанную с a–группами маннозу, а агглютинин проростков пшеницы— олиго-сахара, связанные с аспарагином через сиаловую кислоту, N–ацетилглюкозу и остатки N–ацетилгалактозамина. Роль охарактеризованных углеводных остатков в связывании с IgE может быть установлена сравнительной оценкой этого свойства гликозилированных и дегликозилированных аллергенных белков.

Чрезвычайно важной теоретической и практической проблемой является проблема перекрёстных свойств разных аллергенов. Данные исследований этой проблемы очень разноречивы. В одном из них в последнее время получены результаты, позволяющие удачно объяснить перекрёстные свойства аллергенов пыльцы разных видов растений. Показано, что такие перекрёстные свойства могут быть связаны с растительными профилинами, содержащимися в пыльце растений. Эти профилины распознаются актином, входящим в состав оболочки растительной клетки, выделение профилинов осуществимо хроматографией на колонках, содержащих полипролин. Таким образом, может быть получен продукт, ответственный за общие аллергенные свойства целого ряда аллергенов пыльцы.

Ферменты, входящие в состав аллергенов и ответственные за их алергенную активность, могут быть выделены афинной хроматографией с использованием соответствующих субстратов или ингибиторов этих ферментов. Так, один из индивидуальных аллергенов, входящих в состав Dermatophagoides pteronissinus, имеет высокую гомологию с глутатион-S-трансферазой и может быть выделен на колонке, содержащей глутатион. Группа аллергенов D. pteronissinus и D. Farinae — трепсиноподобные серинэстеразы. Соответственно, они могут быть выделены на аффинных колонках, содержащих ингибиторы трипсина.

Наконец, молекулярное клонирование аллергенов делает принципиально возможным синтез неограниченного количества клонально чистого белка для модифицированных аллергенов и пептидов или последующего изучения их функции.

Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 998 | Нарушение авторских прав