АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕННЫХ ДЕФЕКТОВ

Точным, хотя и дорогостоящим, методом для характеристики генов заболевания у индивидуальных пациентов можно считать клонирование этих генов и полное секвенирование. Грубую информацию о структурных генных повреждениях получают посредством так называемого рестрикционного анализа. При этом геномную ДНК пациентов разрезают с помощью специфических энзимов (рестрикционных эндонуклеаз), разделяют при помощи электрофореза и гибридизируют с помощью специфического генного зонда [48]. Из полученного таким образом рестрикционного образца распознаются большие генные дефекты, а часто даже патогенные точечные мутации. Современная технология, которую можно использовать для быстрого доказательства таких мутаций, и есть так называемая полимеразная цепная реакция - ПЦР [14]. Технология ПЦР используется для диагностики моногенных, а также инфекционных и злокачественных заболеваний. Ее принцип - размножение (амплификация) in vitro сегмента ДНК, имеющегося в мизерном количестве. Это автоматизированный процесс с использованием последовательно специфического праймера - олигонуклеотида и термоустойчивой синтезированной ДНКполимеразы для энзиматического увеличения количества ДНК на выходе. На практике из нескольких микролитров крови пациента выделяют геномную лейкоцитарную ДНК, которая содержит мизерные количества необходимой для исследования целевой последовательности. Для структурного анализа (например, секвенирования) эти количества были бы слишком незначительны, однако с помощью ПЦР они амплифицируются более чем в 106 раз. Помимо геномной ДНК, могут амплифицироваться и секвенироваться индивидуальные рибонуклеиновые кислоты (РНК). Для этого сначала выделяют клеточную общую РНК, которая используется для синтеза in vitro комплементарной ДНК (сДНК), а затем амплифицируется как обычная ДНК с помощью ПЦР.

В последнее время появились методы, позволяющие прямо секвенировать ПЦРпродукты из геномной ДНК без предшествующего клонирования [44]. Эта технология освобождает от необходимости клонирования индивидуального гена и имеет большое значение для характеристики генных дефектов. В распоряжении исследователя для реализации этой технологии имеются специальные радиоактивные и автоматизированные протоколы.

Генное сканирование.

Хотя ПЦРамплификация и прямое секвенирование - очень эффективные и быстрые методы для характеристики генных дефектов человека, все-таки пока есть определенные проблемы. Одна из них - обследование (сканирование) гена в целом на наличие точечных мутаций. Эта проблема возникает, например, при анализе кандидатных генов и подозрении, что они несут при определенном заболевании патогенные мутации, распределенные на протяжении всего гена. В качестве предварительного этапа секвенирования при такой проблеме разработали так называемую технику генного сканирования, которая позволяет ответить на вопрос, имеются ли вообще какие-либо мутации в обследуемой области. Тогда при наличии этой предварительной информации, а затем при окончательной характеристике посредством секвенирования возможно ограничение на действительно нужной (позитивной) области обследования. Все техники сканирования базируются на ПЦРтехнологии и при относительно небольшой трудоемкости позволяют обследовать гены на наличие мутаций у большого числа пробандов.

Дата добавления: 2015-01-18 | Просмотры: 1114 | Нарушение авторских прав